与传统显微镜相比，激光激光激光共聚焦显微镜具有高分辨率，高灵敏度和高放大倍率。随着软件开发和应用技术的发展，激光激光激光共聚焦显微镜已成为形态学，分子细胞生物学，神经科学，药理学和遗传学领域的新一代强大的研究工具。

一、通过激光共聚焦显微镜进行样品制备

激光共聚焦显微镜样品制备是检测前的关键步骤。样品需要用荧光探针（单，双和三）标记。

标本可以是固定的或活组织，或固定或活的贴壁培养。细胞应在共聚焦特殊培养皿或盖玻片，悬浮细胞，萼片或滴剂和盖玻片上培养，覆盖。

样品至大厚度约1~2mm，盖玻片厚度应小于0.17mm，滑块厚度应在0.8~1.2mm之间，表面光滑，厚度均匀，并且没有明显的干扰荧光。固定样品通常用密封片密封，通常使用通过使用pH 8.5-9的PBS制备的甘油密封。

二、常规样品制备要求

⒈染料的选择

由于激光共聚焦显微镜使用单波长激光作为光源，因此荧光染料的选择应基于激光共聚焦显微镜的激光波长。如果同一样品中有多种荧光染料，请尽可能考虑它们的发射波长。不要重叠并避免交叉颜色问题。

⒉样品载体的选择

一般的共焦显微镜高倍物镜是一种油镜。其数值孔径小，镜片与样品之间的工作距离不大于0.17mm。因此，如果观察样品是粘附细胞或组织切片，则可以使用普通负荷。

幻灯片和盖玻片都可以。如果是悬浮细胞或悬浮颗粒，可以通过在专用于激光激光激光共聚焦显微镜的培养皿中携带样品来观察。

⒊密封片的选择

如果仅需要观察样品一次并且不太容易淬灭荧光，则可以使用一定浓度的甘油混合物来密封膜。如果样品需要放置一段时间并且需要多次使用，则应使用抗荧光淬火密封来减少荧光信号损失。

三、激光共聚焦显微镜操作步骤

⒈根据荧光探针的激发和发射波长选择合适的激光，激光功率，光谱滤光片和发射滤光片。

⒉确定扫描方法：点，线，面，3D扫描。

⒊确定扫描密度（分辨率）：256×256,512×512,1024×1024,2048×2048，分辨率越高，扫描速度越慢，图像信噪比越好，但越多可能会发生光漂白。

⒋选择共焦显微镜物镜的倍数和电子放大倍率：确定此条件后，确定扫描范围，物镜的透光率与数值孔径（NA）的四次方成正比，并且物镜放大倍数的平方。因此，反比例，应尽可能选择具有高数值孔径的物镜。

⒌根据样品的制备质量，选择合适的针孔尺寸，调节激光管电压，光电倍增管功率，降噪等，达到至佳状态。这些参数的选择或设置非常紧密，应该全方面考虑。

⒍确定光线切割范围，即扫描样品的厚度，起始位置和结束位置。

⒎给出了由光切割的层数和拍摄时的累积平均次数。

⒏获取图像并保存。

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