药品原料药和制剂的生产过程中，不可避免地会产生或引入影响药物稳定性甚至威胁人类健康的杂质，比如在血管紧张素受体拮抗剂 (ARB)、雷尼替丁及其他药物中发现潜在致癌物-亚硝胺杂质。1987年亚硝胺类化合物（NAs）被国际癌症研究机构（IARC）列入致癌物清单，2017年国际人用药品注册技术协调会（ICH）评估和控制药物中DNA反应性（致突变）杂质的ICH M7指导原则将致癌风险高的NAs列为“关注队列”。

　　在酸性条件下，若仲胺、叔胺或季胺和亚硝酸盐同时存在，则有可能形成亚硝胺。药物原料药生产过程中采用的起始原料、试剂、催化剂、溶剂、中间体以及被污染的设备和试剂都有可能造成亚硝胺杂质的生成。此外，药物制剂过程中采用的辅料以及药物因储藏条件而发生氧化、分解等反应也会在药物中引入亚硝胺杂质。其中有机溶剂在API生产及药品的分离、纯化过程中发挥着至关重要的作用，根据FDA（美国食品药品监督管理局）和EMA（欧洲药品监督管理局）的指导原则，药品生产过程中使用的有机溶剂是亚硝胺杂质的潜在根源之一。因此对药物及药品生产使用有机溶剂中亚硝胺类杂质的种类、含量测定和成因分析，近年来已成为制药行业关注的要点。

　　为应对亚硝胺危机，USP（美国药典委员会）经方法测试及风险评估后建立了几个亚硝胺参考标准，并发布了新的《美国药典—国家处方集(USP-NF) 》通则<1469>亚硝胺杂质，以支持行业分析和监测药品供应链中的亚硝胺。2020年版《中国药典》四部通则9306亦有体现，国家药品监督管理局药品审评并于2020年5月8日发布了《化学药物中亚硝胺类杂质研究技术指导原则（试行）》的通告（2020年1号）。

　　FDA曾报告了一种采用GC-MS/MS结合直接进样的方法测定有机溶剂中NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA和NDBA等亚硝胺杂质，但对于未知杂质较多的商用级溶剂的分析中，对于未知杂质干扰的排除及未知杂质与亚硝胺杂质峰的分离度方面还面临一些挑战。基于此，USP使用岛津高灵敏度GCMS-TQ8050 NX三重四极杆气质联用系统开发了一种高灵敏度的GC-MS/MS分析方法，用于二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和邻二甲苯溶剂中同时测定六种亚硝胺杂质(NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA和NDBA)，并验证了该方法的有效性。

仪器和分析条件

溶液和样品制备

注：所有溶液均在棕色容量瓶中配制

结果与讨论

1、方法开发

　　商用溶剂中存在较多的干扰杂质以至于影响亚硝胺的准备识别，通过优化MRM离子对、碰撞能量以减少未知杂质的干扰（MRM条件优化结果见下表1），此外对柱温程序也进行优化，并改变检测器增益（0.8kv）以提高方法的灵敏度（相对于商用溶剂样品浓度达到100 ppb）。同时对于样品浓度，经测试样品浓度为25 mg/mL时可以减少干扰并保持高的灵敏度。由于亚硝胺的原位形成，GCMS使用的高温可能会导致亚硝胺测试结果偏高。通过空白进样，未观察到亚硝胺出峰位置有干扰。此外室温下48h稳定性测试亦未发现亚硝胺杂质发生变化。

　　进一步使用分析级溶剂对方法进行验证，再次证实了原FDA方法商用溶剂中未知杂质影响了分析方法的灵敏度，其中相对于100 mg/mL的样品浓度NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA的LOQ为5 ppb，NDBA的LOQ为13 ppb。与FDA报道的方法相比，优化后的方法对不同纯度溶剂样品中亚硝胺的分析具有良好的分离度和高灵敏度。

表1  6种亚硝胺的MRM条件（离子对、CE值、扫描时间）

注：N-亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二乙胺（NDEA）、N-亚硝基乙基异丙基胺（NEIPA）、
N-亚硝基二异丙胺（NDIPA）、N-亚硝基二苯胺（NDPA）、N-亚硝基二丁胺（NDBA）

2、方法学验证

　　用所建立的GC-MS/MS方法对二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和邻二甲苯等商用溶剂和分析级溶剂中的6种亚硝胺进行测定，验证标液浓度完全覆盖FDA相关限值要求，通过色谱分离专属性、线性、准确度、重复性、中间精细度等多个指标验证了该方法的可靠性。验证方法及结果分见表2和图2 。

表2 方法学验证程序及结果

RLL-低浓度水平加标回收率（5 ppb* (NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA)和13 ppb*(NDBA) ）
RML-中浓度水平加标回收率（1000 ppb* ）
RUL-高浓度水平加标回收率（2000 ppb*）
*：相对于100 mg/mL的样品浓度

图2 （A) LOQ溶液色谱图 （0.5 ng/mL (NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA)和1.3 ng/mL (NDBA)）
(B)  MRM-1和MRM-2提取离子色谱图

3、样品分析

使用经验证的方法对二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和邻二甲苯等商用溶剂进行测试，结果发现，甲苯被550 ppb的NDEA污染，邻二甲苯被120 ppb的NDEA和3400 ppb的NDBA污染。在上述商用溶剂和其他分析级的二氯甲烷和乙酸乙酯溶剂中未检测到亚硝胺。

总结

　　溶剂在制药工业中被广泛用作原料药和制剂的反应介质和其他步骤。溶剂生产和运输过程中添加的化学品、生产过程中的污染以及溶剂回收等都是商用溶剂中亚硝胺的潜在来源。USP使用岛津高灵敏度的GCMS-TQ8050 NX系统开发了在药品生产中广泛使用的二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和邻二甲苯溶剂中的六种亚硝胺的高灵敏度的检测方法，该方法对于商用级和分析级溶剂都能实现满意的检测效果。

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