激光共聚焦显微镜是一种先进的分子和细胞生物学分析仪器,它使用计算机,激光和图像处理技术从生物样品中获得三维数据。它主要用于观察活细胞的结构以及特定分子和离子的生物变化,定量分析和实时定量测定。
激光共聚焦显微镜使用点光源照亮标本,在焦平面上会形成一个清晰的小光斑,该点发出的荧光被物镜收集,并被送回到双向色光分束器。沿原始辐照光路反射镜。分光镜将荧光直接发送到检测器。光源和检测器的前面有一个针孔,称为照明针孔和检测针孔。
两者的几何尺寸相同,大约为100-200nm。相对于焦平面上的光斑,两者是共轭的,即光斑穿过一系列透镜,最终可以同时聚焦在照明针孔和检测针孔上。以此方式,来自焦平面的光可以会聚在检测孔的范围内,而来自焦平面上方或下方的散射光被阻挡在检测孔之外并且不能被成像。
激光共聚焦显微镜的激光逐点扫描样品,检测到针孔后的光电倍增管也逐点获取相应光的共焦图像,将其转换为数字信号,传输到计算机,最后会聚在屏幕上变成整个焦平面的清晰共焦图像。
每个焦平面图像实际上是标本的光学横截面。该光学横截面总是具有一定的厚度,这也称为光学片。因为焦点处的光强度远大于非焦点处的光强度,并且非焦平面光被针孔过滤,所以共焦系统的景深大约为零。
沿Z轴扫描可以实现光学层析成像扫描,形成在聚焦点观察样品的二维光学截面。 X-Y平面(焦平面)扫描与Z轴(光轴)扫描相结合。通过累积连续水平的二维图像并通过特殊的计算机软件进行处理,可以获得样品的三维图像。即,由于检测针孔和光源针孔总是聚焦在同一点,所以在聚焦面外激发的荧光不能进入检测针孔。
激光共聚焦显微镜工作原理是它使用激光作为光源。在传统的荧光显微镜成像的基础上,增加了激光扫描装置和共轭聚焦装置,并通过计算机控制了数字图像的采集和处理系统。
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